通過冰芯取樣表征藥物瓶中的冷凍過程

通過冰芯取樣表征藥物瓶中的冷凍過程

摘要

原料藥 (DS) 的冷凍是一項關(guan) 鍵的單元操作，可能會(hui) 影響產(chan) 品質量，可能導致蛋白質聚集和不可見顆粒的形成。冷凍濃縮已被確定為(wei) 影響冷凍期間蛋白質穩定性的關(guan) 鍵參數，因此應盡量減少。宏觀冷凍濃縮（以下僅(jin) 稱為(wei) 冷凍濃縮）主要受冷凍速率的影響，而冷凍速率又受獨立於(yu) 產(chan) 品的工藝參數的影響，例如 DS 容器、其大小和填充水平以及冷凍設備。（大規模）工藝特性研究對於(yu) 理解和優(you) 化冷凍工藝至關(guan) 重要。然而，評估冷凍濃縮需要對冷凍塊進行取樣，這通常是通過將冰塊切成碎片進行後續分析來完成的。此外，這些研究對大量產(chan) 品的需求是一個(ge) 主要限製。在這項研究中，我們(men) 報告了一種簡單的方法的開發，該方法使用替代溶液在相關(guan) 規模上對瓶中的冷凍 DS 進行實驗表征。新型冰芯取樣技術確定中心的軸向冰芯可指示低溫濃縮，低溫濃縮通過滲透壓和組氨酸與(yu) 聚山梨醇酯 80 (PS80) 的濃度來測量，而滲透壓則顯示是一種靈敏的讀數。最後，我們(men) 通過比較不同冷凍方案（-80°C vs -40°C）的低溫濃縮來舉(ju) 例說明該方法研究 DS 瓶中低溫濃縮的適用性。冷凍過程中的延長應激時間與(yu) 2 L DS 瓶軸向中心滲透壓量化的更高程度的低溫濃縮相關(guan) 。

關(guan) 鍵詞 低溫濃縮 · 藥物瓶 · 冷凍保存 · 大規模冷凍 · 工藝表征

介紹

在生物製藥製造中，原料藥(DS) 通常以批量方式冷凍，以提高儲(chu) 存穩定性並大程度延長保質期。儲(chu) 存的目標冷凍溫度通常為(wei) -20°C、-40°C 或 < -65°C，並且不同公司的冷凍/解凍 (F/T) 設備、規程和目標溫度可接受範圍通常不同。冷凍 DS 可以長期穩定 DS，降低生物負荷控製（因此為(wei) 非無菌）DS 中任何潛在微生物生長的風險，並避免 DS 和藥物產(chan) 品 (DP) 的累積穩定性。此外，冷凍 DS 還可以將 DS 與(yu) DP 製造分離，同時提高 DP 生產(chan) 的靈活性。另一方麵，生物 DS 的冷凍和隨後的解凍可能會(hui) 引發物理不穩定性，這可能會(hui) 影響產(chan) 品質量，導致蛋白質聚集和顆粒。為(wei) 了減少 F/T 相關(guan) 壓力和對產(chan) 品質量的潛在影響，需要了解 F/T 操作，以充分設計和控製這些關(guan) 鍵工藝步驟。

冷凍過程尤其會(hui) 對產(chan) 品穩定性產(chan) 生不利影響。已發現各種應力條件可能會(hui) 在冷凍過程中破壞蛋白質製劑的穩定性，包括冰/液界麵處的表麵誘導降解以及與(yu) 冷凍濃縮（也稱為(wei) 冷凍濃縮）相關(guan) 的不同條件。微觀冷凍濃縮是指溶質在冰晶之間微觀空間中的必然濃縮，而宏觀冷凍濃縮則描述了溶質在宏觀層麵（厘米級）上的運輸。

宏觀冷凍濃縮發生在溶液冷凍過程中，此時溶質被排除在不斷增長的冰之外並逐漸濃縮，導致在達到玻璃化轉變溫度 (Tg’) 之前達到最大冷凍濃度，即整個(ge) 係統凝固。這種宏觀冷凍濃縮（下文中將簡稱為(wei) 冷凍濃縮）可能通過不同的機製導致蛋白質製劑不穩定，包括輔料結晶可能導致 pH 值變化、離子強度增加以及緩衝(chong) 劑與(yu) 蛋白質之間的特定比例變化。值得注意的是，導致蛋白質不穩定的各種冷凍相關(guan) 降解機製是配方和蛋白質有的，通常無法相互區分。盡量減少冷凍濃縮，從(cong) 而在冷凍期間和冷凍後實現更均勻（同質）的濃度分布是可取的，這也被認為(wei) 有利於(yu) 蛋白質穩定性。

最重要的是，冷凍濃縮受多個(ge) 產(chan) 品和配方獨立工藝參數的強烈影響，例如冷凍設備、容器類型、幾何形狀和填充水平。這是因為(wei) 這些參數會(hui) 影響冷凍速率和冷凍方向。因此，可以獨立於(yu) 活性藥物成分 (API) 進行表征冷凍濃縮的工藝特性研究，例如通過使用替代配方。建議在代表性配置和規模下進行研究，即在 DS 瓶中。冷凍對產(chan) 品質量的影響，即研究產(chan) 品相關(guan) 參數，可以在模擬所需低溫濃縮的合適小規模模型中進行，因為(wei) 大量 DS材料的可用性通常是製造規模工藝特性研究的主要限製。

無論使用何種冷凍工藝和設備，都必須很好地表征該工藝，以便理想地使用不同的冷凍和解凍速率。與(yu) DS 袋不同，由於(yu) 缺乏市售的活性 F/T 係統，以及在擴大規模過程中與(yu) 幾何相關(guan) 的工藝挑戰，DS 瓶中的控製冷凍尤其具有挑戰性。簡而言之，增加瓶子尺寸會(hui) 導致表麵與(yu) 體(ti) 積比降低，這會(hui) 嚴(yan) 重影響熱交換，減慢冷凍過程並可能增加冷凍濃縮。因此需要很好地了解不同規模的冷凍過程。

與(yu) F/T 研究不同，在 F/T 研究中可以在冷凍和解凍後甚至在多次 F/T 循環後收集和分析液體(ti) 樣品，而冷凍過程本身的表征需要對冰塊進行取樣，以便分析冷凍狀態下的冷凍濃度。這些冷凍取樣程序通常費力且耗時，需要特定工具將冰塊切成隨後可進行分析的碎片。先前的研究通常使用帶鋸切割冰塊，而其中一些研究還報告了與(yu) 這些程序相關(guan) 的具體(ti) 挑戰 [31–33]，總體(ti) 而言，此類研究通常僅(jin) 包括少數實驗條件和很少或沒有實驗重複。

與(yu) 之前專(zhuan) 注於(yu) 蛋白質穩定性的冷凍研究相比，我們(men) 開發了一種簡單、快速的方法來研究冷凍狀態下的低溫濃縮並評估與(yu) 產(chan) 品無關(guan) 的工藝參數，例如冷凍設備、冷凍機類型、冷凍目標溫度、容器類型、容器大小等。在本研究中，我們(men) 提出了一種新穎的采樣技術，通過冰芯鑽孔結合替代溶液的使用，可以表征 DS 瓶中的冷凍過程，從(cong) 而確定進一步研究的關(guan) 鍵工藝參數。取樣從(cong) DS 瓶的頂部進行，並進一步優(you) 化，以通過僅(jin) 取樣相關(guan) 位置來減少取樣工作量。替代溶液中溶質的低溫濃縮程度通過滲透壓、組氨酸和 PS80 含量來量化。為(wei) 了舉(ju) 例說明該方法，我們(men) 比較了在 -40°C 與(yu) -80°C 靜態冷凍條件下 2 L DS 瓶中的低溫濃度，以證明區分不同冷凍方案的適用性。

材料和方法

樣品製備

製備了代表標準單克隆抗體(ti) (mAb) 配方的替代溶液，該替代溶液包含 20 mM L-組氨酸緩衝(chong) 液、240 mM 蔗糖、10 mM L-蛋氨酸和 0.04% 聚山梨醇酯 80 (PS80)，pH 值為(wei) 5.5（Tg’ -34°C，~ 1.3 cP）。L-組氨酸、L-組氨酸 HCl、L-蛋氨酸和 PS80（J.T. Baker）從(cong) VWR（瑞士迪提康）購買(mai) ，蔗糖從(cong) Pfanstiehl（瑞士祖格）購買(mai) 。使用從(cong) VWR（瑞士迪提康）購買(mai) 的 0.22 µm PVDF 過濾器對製備的替代溶液進行無菌過濾。

將 2 L 替代溶液裝入 SaniSure（盧森堡巴沙拉日）提供的 2 L 聚碳酸酯 PharmaTainer™ 瓶中，並在 Thermo Fisher Scientific（美國北卡羅來納州阿什維爾）的 -80°C 超低溫 (ULT) 冰箱 Revco™ (RDE50086FV) 或 Snijders Labs（荷蘭(lan) 蒂爾堡）的 -40°C 低溫冰箱 (VF360-45G) 中被動冷凍。

在開始實驗運行之前，將單個(ge) DS 瓶放置在空冰箱底架的中央，並將門打開時間為(wei) 1 分鍾。

Ice Core Sampling 冰芯取樣

如圖 1 所示，使用冰芯鑽孔技術對冷凍取樣獲得的樣品進行冷凍後溶液成分的低溫濃縮分析。

連續使用兩(liang) 種不同的設置。第一種設置每瓶收集三個(ge) 軸向冰芯（圖 1a）進行橫截麵分析。對於(yu) 邊緣（E）和半徑向距離（H）冰芯位置的取樣，在冷凍前將瓶子的上部切掉並用膠帶緊緊封閉。優(you) 化的設置（圖 1b）僅(jin) 通過瓶口收集瓶子徑向中心的冰芯。頂部的第一個(ge) 樣品總是用直徑為(wei) 21 毫米的不鏽鋼手動取芯器手動取出，取樣深度約為(wei) 20 毫米，以標記後續機器鑽孔的位置。

為(wei) 了在冰芯中鑽孔，將瓶子緊緊固定在虎鉗中，並使用配備不鏽鋼芯鑽（內(nei) 徑：16 毫米，外徑：21 毫米，長度：200 毫米）的電鑽機（SFS Group，瑞士 Heerbrugg）進行鑽孔，該鑽機來自 Bürkle GmbH（德國巴特貝林根）。使用樣品彈出器附件將冰芯從(cong) 空心芯鑽中輕輕取出，並放置在幹淨的工作表麵上，預先標記好 25 毫米的部分（圖 1c）。將樣品分離並轉移到試管中進行解凍，並從(cong) 底部開始編號。由於(yu) 冷凍後在冷凍塊中心存在冰山，因此收集的樣品數量從(cong) 11 到 13 不等。此外，由於(yu) 瓶子中心的凹形，H 和 E 軸上的鑽孔深度略深。為(wei) 了消除采樣程序（開放式處理）中潛在的外部顆粒汙染，樣品解凍後用 5.0 µm PVDF MillexSV 注射器過濾器（Merck，瑞士 Buchs）進行過濾，然後儲(chu) 存在 -80°C 下直至分析。

溫度曲線

在一個(ge) 案例研究中，應用兩(liang) 種不同的冷凍方案，即冷凍至 -80°C（RDE50086FV Revco™ ULT 冷凍機）或 -40°C（VF360-45G 低溫冷凍機），在冷凍過程中記錄了溫度曲線。

對於(yu) 進行冰芯鑽探的 DS 瓶，使用 Testo（瑞士門夏爾特多夫）的 Pt-100 溫度探頭記錄 DS 瓶外部的溫度（見圖 1b）。作為(wei) 對照，使用相同的溫度映射設置記錄了單獨的對照瓶中的溫度曲線，但在液體(ti) 中放置了額外的 Typ-T 熱電偶（來自 TC GmbH）（見圖 2），以便將對照瓶的溫度曲線與(yu) 用於(yu) 冰芯采樣的瓶子的溫度曲線進行比較。通過比較可以將對照實驗中估計的應力時間轉移到用於(yu) 冰芯鑽探的 DS 瓶中。對於(yu) 控製溫度測量，將熱電偶放置在第一個(ge) 凍結點 (FPF) 和最後一個(ge) 凍結點 (LPF) 處，並使用相同的凍結方案進行凍結。對於(yu) 本研究中使用的配置（被動凍結一個(ge) 裝滿 2 L 的 2 L DS 瓶），FPF 和 LPF 分別位於(yu) 邊緣底部和徑向中心，液位高度約為(wei) 1.5 L，如先前確定的。

分析溫度曲線，從(cong) 兩(liang) 個(ge) 獨立的溫度映射實驗中評估應力時間的平均值和標準偏差，作為(wei) FPF 處 < 0°C 到 LPF 處 -34°C 之間的時間跨度，即替代溶液的 Tg'。

圖 1 冷凍 DS 瓶中冰芯取樣技術和溫度監測示意圖。a 橫截麵分析：在不同徑向位置（瓶子的側(ce) 麵和頂視圖）取樣三個(ge) 冰芯，即在中心 [C]、半徑向距離 [H] 和邊緣 [E]。b 中心芯分析：通過瓶口取樣中心芯。溫度探頭連接在瓶子外部，用於(yu) 在冷凍期間記錄溫度。c 帶有冰芯樣品彈出器的冰芯鑽頭和彈出的冰芯，分成 25 毫米長的樣品

圖 2 DS 瓶內(nei) 的溫度測繪裝置示意圖，用於(yu) 記錄第一個(ge) 凍結點 (FPF)、最後一個(ge) 凍結點 (LPF) 和瓶外的溫度

溫度數據由 OMEGA Engineering GmbH（德國 Deckenpfronn）的 RDXL6SDUSB 數據記錄器記錄，並使用 Origin Lab 軟件版本 2023（OriginLab Corporation，美國馬薩諸塞州北安普敦）進行評估。

分析方法

滲透壓

滲透壓濃度通過凝固點降低測量，使用 Gonotec 的 Osmomat 3000 儀(yi) 器，該儀(yi) 器由 Haslab GmbH（瑞士比爾本肯）訂購。樣品在校準範圍內(nei) 測量三次，範圍在 0 mOsmol/Kg 和 850 mOsmol/Kg 之間。如果需要進行分析，樣品用水稀釋。

PS80 量化

PS80 通過 Brito & Vaz 描述的 HPLC-熒光膠束測定法進行定量分析。簡而言之，根據 Schmidt 等人的方法測量未稀釋的樣品。使用 Waters Acquity Arc Premier 係統（瑞士巴登）與(yu) Waters 2475 熒光檢測器（瑞士巴登）耦合。使用 0.004% 至 0.1% 之間的校準範圍，如果需要，用水稀釋樣品。

組氨酸定量

采用毛細管區帶電泳 (CZE) 方法對組氨酸進行定量分析，所用設備為(wei) SCIEX PA800plus 係統（Brea；美國），該係統配備有紫外檢測器、214 nm 濾光片（SCIEX）、溫控自動采樣器和 30 kV 電源。測量采用 Molex（Lisle；美國）的熔融石英毛細管進行，其內(nei) 徑為(wei) 30 µm，長度為(wei) 20/30 cm。在一個(ge) 序列中，樣品儲(chu) 存在 10°C 的自動采樣器中。對於(yu) 分離緩衝(chong) 液，使用 150 mM 磷酸鹽溶液（pH 1.5）與(yu) 5% IPA 混合。在注入樣品之前，用 1 M HCl、H2O 和背景電解質衝(chong) 洗毛細管，或每次在 50 psi 下衝(chong) 洗三分鍾。通過三次標準 CZE 運行和一個(ge) 空白，使新鮮的毛細管平衡以適應分離緩衝(chong) 液條件。分離電壓設定為(wei) +28 kV。使用的校準範圍為(wei) 1 至 100 mM 組氨酸，並向每個(ge) 樣品中添加 20 mM 4-氨基苯甲酸作為(wei) 內(nei) 標。

數據評估

低溫濃縮分析結果以濃度因子表示，其計算方法是將樣品濃度除以替代溶液的初始濃度。使用 OriginPro 2023 版（OriginLab Corporation，美國馬薩諸塞州北安普頓）對數據進行可視化。

結果與(yu) 討論

DS 瓶中的低溫濃度分布圖

建立了冰芯取樣方法，以研究裝有 2 L 替代溶液的 2 L DS 瓶中的低溫濃縮，該替代溶液代表 mAb 配方。在第一個(ge) 設置中（圖 1a），在從(cong) 三個(ge) 軸向冰芯收集的樣品中確定了在 -80°C 下冷凍後 2 L 瓶中溶質的分布。滲透壓（圖 3a）被測量為(wei) 一個(ge) 依數參數，代表替代溶液中的組氨酸和蔗糖濃度；組氨酸（圖 3b）被量化為(wei) 緩衝(chong) 係統和可能的 pH 平衡的變化指標，PS80（圖 3c）被量化為(wei) 生物製劑配方中穩定界麵應力的關(guan) 鍵賦形劑。對於(yu) 所有三個(ge) 測試的配方參數，冷凍本體(ti) 中的溶質分布闡明了朝向冰丘底部中心和頂部的鍾形濃度分布。

之前在不同研究中觀察到了溶質的鍾形濃度，這些研究采用了類似的條件但不同的采樣技術 。例如，將 mAb 製劑在圓形 1 L HDPE 瓶中冷凍至 -70°C（通過滲透壓和 mAb 濃度量化）後，其濃度呈鍾形。同樣，對於(yu) 不同的冷凍方案，Kolhe 及其同事報告了瓶中冷凍的鍾形濃度曲線，而冷凍至 -40°C 和 -20°C 產(chan) 生的冷凍濃縮程度高於(yu) 冷凍至 -70°C 的瓶子。Duarte 等人 使用了與(yu) 本研究中介紹的類似的裝置。他們(men) 將裝滿牛血清白蛋白 (BSA) 溶液的 2 L 矩形 DS 瓶冷凍至 -75°C，但使用了帶有強製空氣對流的幹冰室。作者報告稱，與(yu) 本文中提出的替代溶液的結果相比，2 L 瓶內(nei) 的 BSA 分布情況相當，並且還發現，與(yu) 前麵提到的 Kolhe & Badkar 的研究相反，頂部存在高度濃縮的區域 。Padala 等人在 -30°C 的步入式冷凍櫃中冷凍 10 L 玻璃瓶中的 8.5 kg BSA 溶液後，分析了 BSA 的低溫濃縮情況，甚至發現頂部的濃度最高。

圖 3 a-c 在 -80°C 冰箱中被動冷凍後，2 L DS 瓶中 2 L 替代溶液的中心核心采樣的代表性橫截麵輪廓圖和 d-f 條形圖。數字表示 a、d 滲透壓、b、e PS80 和 c、f 組氨酸的濃度因子。輪廓圖和條形圖使用相同的顏色標度進行視覺比較。對於(yu) d-f，數據表示為(wei) 兩(liang) 個(ge) 實驗的平均值±標準差

在停滯空氣條件下（標準 ULT 冷凍機），瓶內(nei) 被動冷凍預計會(hui) 以從(cong) 外到內(nei) 的徑向冷凍幾何形狀發生，這與(yu) 冰丘的形成有關(guan) 。這些冰丘是由於(yu) 冷凍過程中體(ti) 積膨脹而形成的，這導致因徑向冷凍而滯留在中心的濃縮液體(ti) 被向上推到頂部。

除了不在本研究範圍內(nei) 的配方相關(guan) 參數（例如粘度、Tg’）外，已知與(yu) 工藝相關(guan) 的參數（例如冷卻速率、熱流方向、容器幾何形狀和填充水平）對冷凍後溶質的分布曲線有重大影響。事實上，這些參數影響溶質的對流質量流與(yu) 被滯留在不斷增長的冰中的溶質質量分數之間的相互作用，這最終決(jue) 定了冷凍塊中溶質的分布。例如，凍結鋒速度首先影響冰鋒的形態，而冰鋒的形態決(jue) 定了被困在冰中的溶質的質量分數；其次，溶質離開冰鋒的運動由液相中的擴散和對流決(jue) 定。因此，快速凍結被描述為(wei) 減弱冷凍濃縮的程度。

總之，鍾形低溫濃度分布被認為(wei) 是 DS 瓶中典型的徑向和慢速冷凍幾何形狀的結果。僅(jin) 部分被困在徑向生長的冰中的溶質被連續輸送到中心，而未凍結液體(ti) 中的密度梯度（由溫度梯度引起）促進自然對流，將溶質向下拖拽的速度高於(yu) 沿徑向中心向上輸送的速度 。容器幾何形狀和熱流方向決(jue) 定了形成的冰幾何形狀，從(cong) 而決(jue) 定了尚未凝固的液體(ti) 的剩餘(yu) 空間，溶質在其中發生對流運動。由於(yu) 被動冷凍 DS 瓶中溶質的分布分布是徑向冷凍幾何形狀的結果，因此高濃度區域預計沿垂直軸。

因此，我們(men) 選擇瓶子中的軸心作為(wei) 分析低溫濃度和優(you) 化冰芯鑽探裝置 1 的代表區域（圖 1a）。優(you) 化設置 2（圖 1b）僅(jin) 從(cong) 軸心芯收集樣本，其中包括最後凝固的代表性中心區域。在優(you) 化設置中，冰芯通過瓶口取樣，如圖 1b 所示，無需切掉瓶子的頂部。

與(yu) 僅(jin) 分析中心芯的優(you) 化設置（圖 3d-f）相比，橫截麵分析報告的溶質濃度（圖 3a-c）產(chan) 生了類似的結果。橫截麵分析中的最高濃度位於(yu) 最底部的中心（位置 1 圖 3d-f），而對於(yu) 優(you) 化設置（中心芯分析），最高溶質濃度可重複地發現略高於(yu) 底部（位置 2 圖 3d-f）。在冷凍過程中，橫截麵分析中瓶子的頂部被切掉並用膠帶固定，這意味著瓶子在設置 1 中不是氣密的/壓力密封的。與(yu) 最終優(you) 化設置中未經操作的瓶子相比，瓶子的操作可能解釋了橫截麵分析中最高溶質濃度位置的輕微變化。與(yu) 文獻數據一致，我們(men) 的研究結果證實，瓶子中冷凍塊體(ti) 徑向軸的中心核既反映了濃度熱點（即頂部和底部附近的最大冷凍濃度），也覆蓋了低濃度區域，例如頂部高濃度部分的下方。

已證明與(yu) 冷凍過程相關(guan) 的不穩定性是冷凍濃縮產(chan) 生不均勻冷凍基質的結果。在濃度較低的區域、賦形劑和蛋白質之間比例發生變化的區域以及頂部的冰丘區域 都觀察到了降解。與(yu) 直覺相反，這意味著蛋白質降解通常不會(hui) 發生在冷凍塊中冷凍濃度最高的區域。

因此，中心核心被認為(wei) 是預測 DS 瓶中冷凍濃縮發生的指示性指標，因為(wei) 它反映了冷凍濃縮的程度，覆蓋了瓶中低濃度和高濃度區域之間的廣泛範圍。然而，對於(yu) 使用截然不同的冷凍工藝（例如，可能對瓶中的冷凍幾何形狀產(chan) 生影響，如氣流冷凍機的情況）的瓶子，建議對瓶子進行擴展分析，以確認中心軸仍然反映瓶子內(nei) 相關(guan) 的感興(xing) 趣區域。值得注意的是，通過瓶子開口取樣的中心核心的優(you) 化設置不需要操縱瓶子，並且大大降低了取樣程序的複雜性和時間。

不同溶液成分的低溫濃縮

為(wei) 了研究冷凍濃縮，我們(men) 分析了滲透壓並量化了替代溶液樣品的 PS80 和組氨酸濃度，並將結果報告為(wei) 濃縮因子。對於(yu) 兩(liang) 種采樣裝置的三個(ge) 讀數，確定了相似的濃縮因子，如圖 3a-c 和 d-f 所示。定量地看，滲透壓和組氨酸的趨勢產(chan) 生了可比的濃縮因子，與(yu) PS80 的濃縮因子相比略高。根據替代溶液的成分，滲透壓主要反映溶液中的組氨酸和蔗糖濃度。

有趣的是，文獻中的幾項研究報告稱，配方輔料（例如糖和緩衝(chong) 鹽）的濃縮程度通常比蛋白質更高，這主要歸因於(yu) 這些分子的不同擴散係數。在 Bluemel 等人的研究中，在含有 PS80 的組氨酸緩衝(chong) 液中配製的 mAb 在 2 L 瓶中冷凍至 -40°C。對冷凍塊中低溫濃縮的分析表明，與(yu) 溶液中的 mAb 和 PS80 相比，組氨酸的濃縮程度更高。濃縮程度確實與(yu) 這三種成分的測量擴散係數相關(guan) 。有趣的是，mAb 和 PS80 的濃縮程度相似，這可以通過 PS80 膠束和 mAb 分子的擴散係數相似來解釋。然而，不能排除 PS80 作為(wei) 一種傾(qing) 向於(yu) 與(yu) 表麵（冰/液體(ti) 表麵）相互作用的表麵活性分子，其行為(wei) 可能與(yu) 其他小分子成分不同，但更相似，就像蛋白質也是兩(liang) 親(qin) 分子一樣。

其他作者描述說，對流驅動的溶質運動主導了擴散的影響，因此得出結論，化合物擴散係數的差異可以忽略不計。

Weber 和 Hubbuch 通過時間分辨在線拉曼光譜從(cong) 機製上研究了溶液中不同成分的低溫濃縮過程。簡而言之，凍結前沿剩餘(yu) 液相中溶質的質量傳(chuan) 輸是分子對流和擴散運動之間複雜相互作用的基礎，這種相互作用受上述過程相關(guan) 參數的影響，也受決(jue) 定分子流動性的溶液特性（如其特定的擴散係數和粘度）的影響。

因此，可以假設溶液中的小分子濃縮到更高的程度，這與(yu) 本研究通過單獨觀察組氨酸濃度或通過滲透壓作為(wei) 組氨酸和蔗糖的累積參數觀察到的結果一致。因此，我們(men) 將滲透壓視為(wei) 一種靈敏的讀數，以研究 DS 瓶中的冷凍濃縮與(yu) 冷凍過程的關(guan) 係。

增加粘度可以通過限製溶液內(nei) 的自然對流和擴散來抵消冷凍濃縮的影響，這種影響甚至在冷卻時會(hui) 加劇，正如 Bluemel 等人所展示的那樣。我們(men) 還可以使用我們(men) 的裝置研究粘度對最終冷凍濃縮的影響。本研究中使用的替代溶液具有相對較低的粘度，代表了一種靈敏的裝置，經過優(you) 化可研究工藝參數。

總之，盡管 PS80 的冷凍濃縮可能對蛋白質分子具代表性，但為(wei) 了研究冷凍濃度與(yu) 冷凍過程參數的關(guan) 係，滲透壓（在我們(men) 的配方中主要代表組氨酸和蔗糖）是靈敏的讀數，同時與(yu) 單個(ge) 成分的含量分析相比，它是一種快速而簡單的分析方法。

案例分析

我們(men) 采用優(you) 化的冷凍取樣方法研究了不同冷凍方案（即不同的目標冷凍溫度 -40°C 和 -80°C）下 2 L DS 瓶中替代溶液的冷凍濃縮。

我們(men) 使用傳(chuan) 統的 -40°C 冷凍機故意誘導更長的應力時間，而 -80°C 冷凍由於(yu) 溫差較低而延長了達到 Tg' 以下溫度的時間跨度。應力時間是從(cong) 冰核開始到達到 Tg'（冷凍基質凝固）的時間跨度。在此時間跨度內(nei) ，液相中的溶質不斷濃縮，因此應力時間可視為(wei) 冷凍過程中冷凍濃縮的指標。

我們(men) 根據圖 2 所示的設置通過溫度映射表征了兩(liang) 種冷凍方案，並確定了在 -80°C 和 -40°C 下冷凍的應力時間分別為(wei) 4.9 小時（± 0.2）和 11.2 小時（± 0.2）。圖 4 顯示了采樣瓶（經過冰芯采樣）外部記錄的代表性溫度曲線和相應溫度。采樣瓶外部記錄的溫度曲線與(yu) 溫度映射實驗的相應曲線相匹配，證明了冷凍程序的可重複性，從(cong) 而證明了用於(yu) 估計實際采樣瓶中應力時間的溫度數據的有效性。

冷凍濃度通過滲透壓定量（圖 5）。在 -40°C 下冷凍與(yu) 在 -80°C 下冷凍相比，產(chan) 生的濃度曲線不同。在 -40°C 下冷凍的瓶子承受的壓力時間是其 2 倍多，導致冷凍濃縮程度更高，而且濃縮的底部區域沿著中心核心分布在更寬的區域。因此，我們(men) 確認冷凍替代溶液的中心核心采樣方法結合滲透壓讀數是一種靈敏的方法，可以表征和區分冷凍方案並研究 2 L DS 瓶中的冷凍濃度。

圖 4 在 a -80°C 冰箱和 b -40°C 冰箱中，2 L DS 瓶中 2 L 替代溶液被動冷凍的代表性溫度曲線。記錄了進行冰芯采樣的瓶子的溫度曲線（紫線），並將其與(yu) 對照實驗記錄的溫度曲線疊加。在相同條件和冷凍方案下冷凍的對照瓶的溫度曲線記錄在瓶子外部（紅線），以及第一個(ge) 冷凍點 (FPF)（紅色虛線）和最後一個(ge) 冷凍點 (LPF)（紅色虛線）

圖 5 在 -40°C 冰箱中被動冷凍後，在 2 L DS 瓶中的 2 L 替代溶液的中心核心中分析的低溫濃縮，顯示為(wei) 滲透壓的濃度因子

應用和限製

在本研究中，我們(men) 報告了一種便捷方法的開發，該方法使用替代溶液在相關(guan) 規模上對 DS 瓶中的冷凍過程進行實驗表征。將所提出的方法與(yu) 以前報告的采樣技術進行比較，幾乎所有的冷凍研究都采用冷凍采樣，即使用帶鋸將冷凍塊切成小方塊。這些程序通常需要首先將容器與(yu) 冷凍塊分離，然後沿三維軸逐片切割冷凍塊或從(cong) 預切切片中取出核心樣本，最終獲得大小相同的樣品塊。在實踐中，這個(ge) 過程很費力，因此很耗時，並且需要特定的設備和設施。此外，以前報告的程序仍然存在一些挑戰，例如需要預冷鋸片或在切割前將樣品存放在幹冰上。此外，根據容器的表麵材料，報告稱冷凍塊與(yu) 容器的緊密粘附，這需要例如加熱接觸麵以將冰從(cong) 容器壁上分離。

然而，所有冷凍采樣技術，包括我們(men) 的岩心鑽探技術，都需要開放式處理，存在樣品受到外部汙染（例如顆粒汙染）的風險。根據所采用的溶液（替代物或蛋白質溶液）和分析方法，應采用適當的樣品製備方法。然而，像本研究中報告的技術一樣，采用更少的處理步驟並且對 DS 容器本身無損的采樣技術最終將減少來自環境和過程的潛在顆粒汙染。

盡管通常沒有明確提及，但采樣程序本身被認為(wei) 對結果有重大影響，特別是對冷凍濃縮的程度，通常報告為(wei) 與(yu) 初始濃度相比的濃度因子。通過冷凍采樣確定冷凍濃度在很大程度上取決(jue) 於(yu) 采樣冰塊的大小，正如之前提到的。值得注意的是，冷凍采樣方法總是描述宏觀的，而不是微觀的冷凍濃縮，因此從(cong) 冷凍塊中收集的樣品的大小/體(ti) 積肯定決(jue) 定了樣品的稀釋程度。例如，在高濃度區域收集的較小尺寸的樣品會(hui) 產(chan) 生更高的最大濃度，這在概念上可以描述為(wei) 方法的“分辨率"。在數據解釋和實驗設計中，應考慮這種不可避免的樣本量依賴性限製。這意味著，使用不同采樣設置和配置的不同研究的結果不能直接相互比較，並且采樣技術從(cong) 冷凍批量中收集相同大小的樣品的能力至關(guan) 重要，即使樣本大小的某些變化是不可避免的，例如由於(yu) 冰結構和成分的變化。本研究開發的技術通過仔細選擇鑽井設備的尺寸並隨後分離冷凍樣品，有助於(yu) 生成小樣本。

由於(yu) 冷凍過程主要由與(yu) 產(chan) 品無關(guan) 的工藝參數決(jue) 定，例如如上所述的容器幾何形狀、尺寸和填充量，因此使用替代品（代替高價(jia) 值的蛋白質溶液）進行工藝表征研究能夠表征冷凍過程，並允許在相關(guan) 的代表性配置和規模（即在 DS 瓶中）下進行實驗表征。使用替代溶液可以進行大量獨立於(yu) 產(chan) 品的實驗和各種工藝參數的測試，從(cong) 而能夠篩選和識別關(guan) 鍵工藝參數。根據冷凍研究的目的，可以優(you) 化替代溶液的性質，使其與(yu) 特定產(chan) 品的性質相匹配，或與(yu) 典型的 DS 溶液的性質相匹配。在我們(men) 的研究中，我們(men) 選擇了一種具有典型配方成分的替代溶液，該替代溶液具有與(yu) 冷凍濃縮相關(guan) 的但最壞情況的性質（低粘度和低 Tg'），以生成一個(ge) 靈敏的設置來量化冷凍濃縮。對於(yu) 以工藝參數為(wei) 重點的工藝表征，滲透壓是一種簡單而有代表性的讀數，用於(yu) 指示替代溶液的冷凍濃縮的發生。

由於(yu) DS 材料的可用性通常是製造規模工藝表征研究的主要限製，因此可以在合適的小規模模型中研究冷凍對產(chan) 品質量的影響，這些模型模擬預期濃度，例如在使用替代溶液進行相關(guan) 規模的補充實驗中確定的濃度。因此，了解冷凍過程和過程參數的相關(guan) 性也使得選擇有意義(yi) 且相關(guan) 的條件進行小規模產(chan) 品質量測試成為(wei) 可能。

結論

冷凍和解凍是生物分子製造過程中的關(guan) 鍵單元操作，必須對其進行充分表征以盡量減少其對產(chan) 品質量的影響。

特別是冷凍過程可能會(hui) 在整個(ge) 冷凍 DS 中產(chan) 生相當大的不均勻性，這與(yu) 許多不利條件有關(guan) ，例如賦形劑和蛋白質濃度的變化、與(yu) 自身相互作用傾(qing) 向的潛在變化相關(guan) 的離子強度變化或 pH 值的變化，這可能會(hui) 影響聚集體(ti) 形成和顆粒物等關(guan) 鍵質量屬性。

為(wei) 了研究 DS 瓶中的低溫濃縮，我們(men) 報告了一種簡單的采樣方法，通過冰芯鑽孔使用滲透壓作為(wei) 一種快速靈敏的讀數，而不是以前耗時且複雜的冷凍采樣技術。我們(men) 的方法特別適合表征與(yu) 產(chan) 品無關(guan) 的工藝參數，例如比較冷凍設備或冷凍方案，如案例研究中所示。使用替代溶液可以在足夠高的分辨率下篩選製造規模的多個(ge) 工藝參數，以便識別關(guan) 鍵工藝參數，而無需大量蛋白質溶液。

縮寫(xie)  API：活性藥物成分；BSA：牛血清白蛋白；C：中心；CZE：毛細管區帶電泳；DS：藥物物質；DP：藥物產(chan) 品；E：邊緣；FPF：第一個(ge) 冷凍點；F/T：冷凍/解凍；H：半徑向距離；LPF：最後一個(ge) 冷凍點；mAb：單克隆抗體(ti) ；PS80：聚山梨醇酯 80；Tg：玻璃化轉變溫度；ULT：超低溫