基於溫度的藥品凍融操作過程表征

基於(yu) 溫度的藥品凍融操作過程表征

在生物製藥生產(chan) 過程中，凍融操作用於(yu) 確保長時間保存期間產(chan) 品的完整性，但它們(men) 也會(hui) 引入額外的壓力，例如可能導致蛋白質活性喪(sang) 失的冷凍濃度梯度。 應對不同規模的凍融操作進行工藝表征，並注意冷凍時間和邊界效應，以確保產(chan) 品在整個(ge) 工藝和工藝開發過程中的穩定性。 目前，過程表征通常依賴於(yu) 一個(ge) 或很少的溫度探頭，這些探頭根據原始溫度檢測凝固時間，而原始溫度在很大程度上受到濃縮溶液冰點降低的影響。 為(wei) 了克服這個(ge) 問題，提出了一種基於(yu) 光纖布拉格光柵傳(chuan) 感器溫度測量的二階導數來檢測結冰的方法。 該方法的適用性通過使用純化水和濃縮製劑的冷凍時間來最小化邊界效應的新型小型凍融裝置的過程表征來證明。 對於(yu) -60 至 -20℃ 的溫度，冷凍時間從(cong) 35 分鍾到 81 分鍾不等，並影響冷凍濃度曲線。 此外，基於(yu) 普朗克方程的凍結時間估計揭示了由於(yu) 啟動溫度梯度而導致的模型局限性，這可以通過經驗擴展的普朗克模型來糾正。 作為(wei) 假設，我們(men) 得出的結論是，從(cong) 冷凍濃度的角度來看，冷凍溫度對於(yu) 冷凍袋等特征冷凍距離較小的容器來說不太重要。 使用二維解析溫度曲線，當冷凍溫度高於(yu) -30℃ 時，觀察到最後一個(ge) 冷凍點從(cong) 容器頂部到底部的移動。

關(guan) 鍵詞：凍融，過程表征，冷凍時間，配方，最後冷凍點

介紹

治療性蛋白質是暢銷的藥物之一。 由於(yu) 其高價(jia) 值和生產(chan) 成本，活性藥物成分 (API) 在運輸和儲(chu) 存過程中的活性損失必須通過選擇合適的製劑試劑來限製 (Chang et al., 2005; Bauer et al., 2017)和儲(chu) 存 狀況。 因此，許多生物藥品都以冷凍狀態儲(chu) 存(Singh et al.,2009;Authelin et al., 雖然冷凍會(hui) 減慢並減少 API 的降解反應，但冷凍過程會(hui) 使蛋白質麵臨(lin) 不同的壓力，例如冷變性（Privalov，1990）、冷凍濃縮(Bhatnagar et al., 2007)、冰晶形成（Chang et al.， 1996），以及潛在的賦形劑結晶。 蛋白質活性損失或聚集與(yu) 冷凍濃度相關(guan) （Reinsch et al.，2015；Roessl et al.，2015）。 在微觀尺度上，水分子的結晶導致冰晶結構內(nei) 剩餘(yu) 溶質的凍結濃縮，從(cong) 而導致蛋白質的凍結溫度依賴性相行為(wei) （Wöll et al.，2019a，b）。 在大規模冷凍操作中，宏觀冷凍濃縮導致溶質分布不均勻。 在冷凍較大體(ti) 積的過程中，冰鋒從(cong) 冷卻的容器壁向容器的中心前進。 冷凍時，溶質濃縮在相邊界前麵並在固相和液相之間分配（Bhatnagar et al.，2007），導致宏觀冷凍濃縮。 此外，由於(yu) 密度梯度，這種冷凍濃縮效應會(hui) 導致自然對流（Butler，2002），從(cong) 而導致溶質沉降。 因此，隨著凍結前沿的出現，峰值濃度出現在凍結體(ti) 中心底部的非典型凍結濃度分布是不可避免的（Maity et al.,2009;Kolhe and Badkar,2011;Roessl et al.,2014; Reinsch et al.，2015）。

縮寫(xie) ：LPTF，最後一個(ge) 凍結點； PTFE、聚四氟乙烯； RMSE，均方根誤差； TRIS，三-（羥甲基）-氨基甲烷

研究表明，冷凍濃度取決(jue) 於(yu) 冷凍過程而不是儲(chu) 存溫度（Hauptmann et al.,2019）。 然而，缺少以傳(chuan) 熱和相變為(wei) 重點的凍融特性研究（Fan et al., 2018），但對於(yu) 確保工藝可擴展性並允許在理想冷凍溫度方麵進行工藝優(you) 化是必要的。 經常用於(yu) 表征凍結過程的一個(ge) 關(guan) 鍵參數是冰鋒速度，它影響最大凍結濃度（Webb et al.,2002；Rodrigues et al., 2011；Hauptmann et al., 2019）和總凍結時間。 凍結時間的確定通常基於(yu) 最後凍結點 (LPTF) 的粗略溫度測量，其中冰鋒在凍結過程結束時聚集在一起。 該計算依賴於(yu) 冰低於(yu) 冰點溫度的假設，由於(yu) 冰點降低發生在高度濃縮的環境中，冰點溫度通常在 -0.5 (Rodrigues et al., 2011) 到 -5℃ (Lashmar et al., 2007) 之間任意設定。 解決(jue) 方案。 此外，溫度探頭必須準確位於(yu) LPTF 位置。 尚未提出一種獨立於(yu) 凝固點降低和 LPTF 位置來確定凝固時間的方法。 在最近的一篇出版物中，建議使用 Plank 方程來模擬製藥過程的總冷凍時間（Authelin et al.,2020），從(cong) 而可以預測和優(you) 化過程時間。 然而，迄今為(wei) 止，藥物冷凍過程中的模型驗證還缺失（Authelin et al.，2020）。

In the following work,a derivative-based temperature analysis for the detection of the total freezing time is presented. This method is used for process characterization of a novel small- scale freeze-thaw model with regards to freezing times at different temperatures. The applicability of the Plank equation on actively cooled pharmaceutical freezing processes is discussed to improve transferability of freezing processes to different scales and freezing setups. An extension of the Plank equation is introduced for correction of transient start-up conditions.

在接下來的工作中，提出了一種基於(yu) 導數的溫度分析來檢測總凍結時間。 該方法用於(yu) 對新型小規模凍融模型在不同溫度下的冷凍時間進行過程表征。 討論了普朗克方程在主動冷卻藥物冷凍過程中的適用性，以提高冷凍過程到不同規模和冷凍裝置的可轉移性。 引入普朗克方程的擴展來校正瞬態啟動條件。

材料和方法

樣品製備

所有使用的溶液均用超純水（PURELAB Ultra、ELGA LabWater、Veolia Water Technologies，Saint-Maurice，France）製備，並在使用前使用 0.2 mm 過濾器進行無菌過濾。 由於(yu) Tris-（羥甲基）-氨基甲烷 (TRIS) 緩衝(chong) 液是蛋白質製劑中廣泛使用的緩衝(chong) 液（Zbacnik  et al., 2017），TRIS 緩衝(chong) 液由購自 Merck（達姆施塔特，德國）的 TRIS 和 Tris-(羥甲基)- 製備而成。 氨基甲烷鹽酸鹽購自 AppliChem（達姆施塔特，德國），濃度為(wei) 500 mM。 使用鹽酸將pH調節至pH 7.5±0.1。 選擇具有單一成分的溶液以減少成分相互作用，並選擇較高的濃度以更好地與(yu) 通常冷凍運輸的高濃度藥物製劑進行比較。 此外，凝固點降低取決(jue) 於(yu) 溶質濃度，這強調需要新的總凝固時間計算方法。 對於(yu) 蛋白質和穩定糖等不同的溶質，預計會(hui) 產(chan) 生類似的濃度效應(Rodrigues et al.,2011)。

新型小型凍融裝置

與(yu) 德國施韋青根 Bilfinger Industrietechnik Salzburg GmbH 共同設計和製造了一種新型小型凍融裝置。 它被設計為(wei) 工業(ye) 規模冷凍裝置的縮小模型，代表較大中空管的切片。 如圖 1 所示，中空圓柱形冷凍裝置由外冷卻套和內(nei) 冷卻管冷卻，而底部單獨加熱，以最大限度地減少縮小邊界效應。 容器體(ti) 積被聚四氟乙烯 (PTFE) 製成的鑲嵌物分為(wei) 六個(ge) 單獨的室。 該嵌體(ti) 允許在每個(ge) 室高達 90 mL 的工作體(ti) 積下執行最多六個(ge) 單獨的實驗。 此外，由於(yu) 導熱率低，PTFE 還可以平衡腔室底部的熱通量，從(cong) 而產(chan) 生如圖 1 橫截麵所示的溫度分布。該 PTFE 底部抵消了由於(yu) 鋼的導熱性而出現的邊界效應 牆壁。 外冷卻壁和內(nei) 冷卻壁由 3 毫米厚的 316L 不鏽鋼製成，半徑分別為(wei) 38 毫米和 100 毫米。 腔室深度為(wei) 40 毫米。 所有管道和鋼製部件均使用 Armacell（德國明斯特）的 20 mm Armaflex 進行絕緣。

凍融裝置的管道和儀(yi) 表圖如圖 1 所示。為(wei) 了達到所需的溫度，裝置的內(nei) 部和外部冷卻回路合並並連接到帶有冷卻液 Kryo 的低溫裝置 Integral XT 1590 90，均購自 Lauda（Lauda-Königshofen，德國）。 安裝了 Krohne（德國杜伊斯堡）流量計、針閥和 2 bar 的設定係統壓力，在內(nei) 回路和外回路中實現了 25 ± 5 L/min 的冷卻液流量。 容器底部由冷卻裝置 F25-MC 和冷卻液 Thermal HY 加熱，兩(liang) 者均購自 Julabo（德國 Seelbach）。 在初步研究中，當冷凍雙去離子水時，發現 0℃ 的恒定底部溫度對於(yu) 容器中平行冷凍前沿所指示的最小邊界效應是理想的（數據未顯示）。 所有裝置均以最大功率運行，沒有任何設定的溫度梯度。 連接到 Ahlborn（Holzkirchen，德國）數據記錄器 ALMEMO 8590 的 PT100 熱電偶在線測量分流前凍融裝置入口處以及內(nei) 回路和外回路兩(liang) 個(ge) 出口流處的冷卻液溫度。 該設置允許設定溫度為(wei) -60 至 30℃。 使用 Mathworks（美國馬薩諸塞州納蒂克）使用 MATLAB App Designer 設計的自定義(yi) 應用程序收集和控製測量數據。 該應用程序自動從(cong) 數據記錄器、兩(liang) 個(ge) 冷卻裝置和上述樣品溫度裝置在線收集和設置所有溫度數據。 在下麵的章節中，冷卻溫度Tcooling是指Kryo 90冷卻單元的溫度，而所有實驗的底部溫度均設置為(wei) 0℃恒溫。 流體(ti) 溫度T∞是指在低溫裝置入口處測得的溫度。 設定溫度Tset是冷卻後在冷卻單元(Tcooling)中達到的溫度。

圖 1 | 實驗裝置。 顯示了帶有兩(liang) 個(ge) 單獨的冷卻單元來控製冷凍室的低溫裝置的管道和儀(yi) 表圖。 冷凍室可視化為(wei) 小型凍融裝置的橫截麵。 冷卻液和 PTFE 嵌體(ti) 的溫度分別用藍色到紅色從(cong) Tset 到 0℃ 的梯度表示。 在橫截麵內(nei) 部，樣品溫度探頭和尺寸（以毫米為(wei) 單位）顯示為(wei) 白色彎曲鋼封裝上的灰點。 管道由箭頭表示。 陰影區域表示實心不鏽鋼和 PTFE。

在進行實驗之前，使用 Otto-chemie（德國弗裏多芬）的食品級矽膠 Ottoseal S27 密封 PTFE 嵌體(ti) 和外殼之間的間隙。 對於(yu) 每個(ge) 實驗，將 90 mL 樣品移入腔室中。 相鄰的室充滿超純水，以盡量減少徑向邊界效應。 冷凍過程開始時在 5℃ 下保持至少 2 小時，以確保平衡起始條件。 平衡後，在最大冷卻坡度下將設定溫度調整為(wei) -60 至-20℃。 當所有樣品溫度傳(chuan) 感器測得溫度低於(yu) -1℃後，底部加熱裝置自動關(guan) 閉以達到低樣品溫度。 如果采取冷凍樣品，則在冷凍後增加 2 小時的保持時間，以確保冷凍過程處於(yu) 平衡。 冷凍步驟後，通過將溫度設置為(wei) 30℃至少1小時來開始解凍。 不同階段的計時是使用上述應用程序自動完成的。

溫度評估

使用 14 個(ge) 溫度傳(chuan) 感器監測樣品溫度，如圖 1 所示，並提供探頭坐標信息。 傳(chuan) 感器位於(yu) Loptek（德國柏林）定製設計的兩(liang) 根預先校準的光纖溫度光纖上，以及來自 Sylex（斯洛伐克布拉迪斯拉發）的詢問器 SCN-46 S-line Scan 416。 這些光纖被直徑為(wei) 1 毫米的不鏽鋼管封裝，並包含多達九個(ge) 光纖布拉格光柵傳(chuan) 感器。 一根帶有六個(ge) 傳(chuan) 感器的光纖位於(yu) 樣品表麵下方 5 毫米處，另一根帶有八個(ge) 傳(chuan) 感器的光纖位於(yu) 腔室地麵上方 5 毫米處，以實現腔室橫截麵的二維解析溫度場。 使用 Sylex（斯洛伐克布拉迪斯拉發）的 S-line Sentinel 軟件每 2 秒獲取一次溫度數據。 與(yu) 常用的熱電偶相比，所使用的溫度監測裝置具有提高溫度分辨率的優(you) 點，同時減少通過傳(chuan) 感器電纜的熱傳(chuan) 導。 我們(men) 預計沿傳(chuan) 感器的熱傳(chuan) 導不會(hui) 影響冷凍過程，因為(wei) 與(yu) 周圍的冰和水相比，1 毫米厚的中空管的熱容量可以忽略不計。

圖 2 | 過程溫度評估示例。 (A) 顯示測量的器件溫度 Tout、T∞ 和 T Cool 以及 13 個(ge) 樣本溫度中的 5 個(ge) 。 菱形表示冷卻時間，三角形表示單個(ge) 探針處的凍結，六邊形表示 LPTF。

各個(ge) 探針處的凍結和 LPTF 時間是根據樣本數據二階導數的最小值計算的，如麵板 (B) 所示。 r表示溫度探頭距冷卻表麵的距離增加。 各個(ge) 樣品溫度曲線在麵板 (B) 中進行了著色，以提高可見性。

查看如圖 2A 所示的典型樣品溫度曲線，可以檢測到兩(liang) 個(ge) 不同的相變時間。 第一個(ge) 轉變發生在觀察到的溫度探針處凍結時，其中溫度降至熔點以下，稱為(wei) 部分凍結時間。 此時，熱力學性質從(cong) 水變為(wei) 冰，導致溫度斜率發生明顯變化。 第二個(ge) 事件表示 LPTF 凍結，稱為(wei) 總凍結時間。 當整個(ge) 塊體(ti) 被冷凍時，不再釋放潛熱，因此所有探頭的溫度將同時降低。 為(wei) 了分析每個(ge) 溫度探頭測量的兩(liang) 次時間，使用 Savitzky-Golay 濾波器對溫度曲線進行平滑和導出兩(liang) 次，並使用二階多項式和 151 個(ge) 數據點的窗口。 二階導數的最小值表示所討論的斜率變化。 應根據稍後討論的數據質量仔細選擇濾波器窗口，其中較小的窗口會(hui) 導致更高的精度，但也會(hui) 導致更高的信噪比。 凍結時間是根據所有 14 個(ge) 溫度測量值計算的，並刪除了基於(yu) 三個(ge) 縮放中值絕對偏差的異常值，以提高計算的穩健性。 然而，由於(yu) 所用光纖傳(chuan) 感器的信噪比較低，部分凍結時間是根據低於(yu) -2℃的溫度確定的。 當將該方法應用於(yu) 熱電偶的溫度讀數時，可以基於(yu) 具有較小薩維茨基-戈萊過濾器窗口的二階導數來分析部分和總凍結時間。

根據設定溫度的低溫度計算直到冷卻液達到設定溫度的冷卻時間。

結冰時間預測

計算總凍結時間 tfreezing 的 Plank 模型（Plank，1913）由 Authelin 等人提出。 （2020）作為(wei) 藥物冷凍過程的模型。 它假設冷卻流體(ti) 溫度 Tcooling 從(cong) 平衡逐步降低到設定溫度，並且在凍結之前主體(ti) 處於(yu) 熔化溫度 Tm。 方程可以寫(xie) 成

其中ρl是液體(ti) 樣品的密度，Δhm是熔化潛熱，X是LPTF和傳(chuan) 熱表麵之間的特征距離（Pham，2005）。 對於(yu) 無限板，幾何因子 E 為(wei) 1，對於(yu) 無限圓柱體(ti) ，幾何因子 E 為(wei) 2，對於(yu) 球體(ti) ，幾何因子 E 為(wei) 3。 比奧數 Bi = kaX/λs 將殼的傳(chuan) 熱阻力 ka 與(yu) 給定導熱係數 λs 的樣品的內(nei) 部導熱阻力聯係起來（Martin，2010）。 對於(yu) 藥物溶液，可以在稀釋溶液的假設下使用固體(ti) 水作為(wei) 溶劑的物理性質(Randall and Rossini, 1929; Kumano et al., 2007)。 假設平衡溫度和熔化溫度之間的溫差可以忽略不計，並且壁溫等於(yu) T∞(Bi→∞)，這對於(yu) 主動冷卻的冷凍係統來說可能是這樣，則冷凍時間可以使用方程 2 來計算。

其中 oC·min 中的 β 是 ρl 、Δhm、X2 、λs 和 E 的函數，總結了給定主動冷凍係統的所有常數值。

冷凍散裝分析

使用來自 Bürkle（德國巴特貝林根）的內(nei) 徑為(wei) 8 毫米的空心鑽頭從(cong) 冷凍塊中取樣。 將一個(ge) 3D 打印支架放置在腔室頂部，該支架以 10.5o 的角度分布在兩(liang) 排不同的行中，具有 9 個(ge) 鑽孔，從(cong) 而在整個(ge) 腔室長度上提供可重複的鑽孔位置。 在徑向邊界效應可忽略不計的假設下，從(cong) 具有重疊樣本體(ti) 積的兩(liang) 個(ge) 不同行進行采樣提高了橫截麵的樣本分辨率，如圖 1 中的實線和虛線所示。 從(cong) 三層 8 毫米高的鑽孔中取樣，最後一個(ge) 孔距室底部 2 毫米。 始終丟(diu) 棄高於(yu) 第一樣品水平的樣品，以避免吸收先前鑽孔和測量來自腔室中心的冷凍濃縮液體(ti) 的冰碎片，該冰碎片被推出膨脹的冰鋒相遇的地方。 將樣品轉移至來自 Eppendorf（德國漢堡）的 2 mL 反應管中並在室溫下解凍。 使用來自Radiometer Analytical SAS（法國裏昂）的電導率計CDM 230通過電導率分析來測量樣品的緩衝(chong) 液濃度。

結果

凍結時間分析

為(wei) 了表征和描述冷凍過程，總冷凍時間是一個(ge) 關(guan) 鍵的過程參數。 總凍結時間可以根據二階導數計算出來，如圖 2 所示。雖然總凍結時間的最小值很明顯，但部分凍結時間的最小值則不然。 當冷凍溫度高於(yu) -25℃時，由於(yu) 溫度傳(chuan) 感器的信噪比較低，所有溫度探頭都無法正確檢測到第一個(ge) 最小值。 因此，當溫度低於(yu) -2℃ 時確定部分凍結時間。通過各個(ge) 探頭的凍結時間，可以監測室內(nei) 冰鋒進展，如圖 3 所示。根據二階導數計算的總凍結時間 所有溫度曲線的結果是純水樣品的標準偏差低於(yu) 2%，高濃度緩衝(chong) 液樣品的標準偏差低於(yu) 4%。 查看圖 2A 中所示的觀察到的過程溫度，由於(yu) 溫度調節，冷卻溫度超過設定溫度最多 3 K，而由於(yu) 鋼外殼的熱容量，流體(ti) 溫度卻沒有超過設定溫度。

過程表征

純化水在不同溫度下冷凍，以表征新型凍融裝置的傳(chuan) 熱性能，因為(wei) 它可用於(yu) 大規模工藝表征。在我們(men) 的研究中，當設定溫度從(cong) -20℃降低到-60℃時，水樣的總冷凍時間縮短了2.3倍，從(cong) 78.7分鍾縮短到33.8分鍾，如圖4所示。與(yu) 在較低冷卻溫度下幾乎停滯的冷凍時間減少相比，在較高冷卻溫度下冷凍時間縮短得更快。基於(yu) 方程2，使用-25至-20℃的數據擬合了估算模型，得出β值為(wei) 1619 C·min，R2=0.972。用-20℃下的數據求解方程2，得到β=1620 C·min。計算出模型和所有設定溫度的均方根誤差（RMSE）為(wei) 1.83分鍾，其中在-25℃以下的溫度下測量的冷凍時間總是超過估計的冷凍時間。根據方程3計算冷卻時間與(yu) 總冷凍時間的比值Ⅱ。從(cong) 總冷凍時間中減去經驗確定的17.3倍Ⅱ，RMSE降低到0.96分鍾，特別是在較低溫度下冷凍時間的估計得到了改進，如圖4所示。

分析冷卻裝置內(nei) 傳(chuan) 熱流體(ti) 的溫度，測得設定溫度為(wei) —30℃及以上時冷卻時間為(wei) 4.2-4.9分鍾。 對於(yu) 較低的設定溫度，冷卻時間大大增加。 冷凍過程開始後，冷卻液與(yu) 低溫裝置出口之間的溫差高達 3 K，在平衡狀態下降至 0.5 K 左右。 使用供應商提供的傳(chuan) 熱流體(ti) 的平均熱容為(wei) 1.5 kJ/kg/K、密度為(wei) 900 kg/m3、流量為(wei) 25 L/min，可估計功率損耗為(wei) 330 至 100 W 處於(yu) 平衡狀態。

樣品溫度

在溫度纖維的幫助下，可以觀察到連續的二維解析溫度場，如圖3所示。假設冷凍樣品的溫度低於(yu) -2℃，則在冷凍過程中可以觀察到冰鋒進展。 當冷凍 500 mM Tris 緩衝(chong) 溶液時，觀察到垂直冷凍前沿，如圖 3A 所示。 在所有實驗中，LPTF 都是在距內(nei) 冷卻壁 26.5 ± 2.5 mm 的距離處觀察到的。 相反，LPTF 的垂直位置隨溫度變化，如圖 3B 所示。 在設定溫度低於(yu) -25°C的實驗中，冷凍前沿首先在容器底部相遇，並且從(cong) 容器底部到頂部有一個(ge) 小間隙結冰，導致LPTF位置位於(yu) 室的頂部。 當水分子的膨脹將液體(ti) 推向主體(ti) 表麵時，就會(hui) 發生這種情況，這與(yu) 在 LPTF 位置處的樣品主體(ti) 頂部觀察到的冰山一致。 在-25℃及以上的高溫設定下冷凍會(hui) 導致容器底部出現LPTF位置，其中剩餘(yu) 的液體(ti) 以收縮鍾的形式凍結。 圖 3C 顯示了基於(yu) 溫度的容器頂部和底部的總冷凍時間與(yu) 根據溫度斜率計算的總冷凍時間的比較。 基於(yu) 斜率的冷凍時間與(yu) 圖 2 所示的純化水觀察到的相似。當設定溫度低於(yu) -25℃ 時，冷凍容器頂部和底部的冷凍時間差異微乎其微，而在設定溫度下冷凍容器頂部和底部的冷凍時間差異高達 9.7 分鍾。 更高的設定溫度。

冷凍散裝分析

將 pH 7.5 的 500 mM Tris 緩衝(chong) 溶液在 -20、-40 和 -60℃ 下冷凍，以評估冷凍溫度對冷凍濃度的影響，結果如圖 5 所示。

在所有冷凍實驗中，最大冷凍集中區域位於(yu) 距離內(nei) 冷卻壁25mm的LPTF位置。 當溫度從(cong) -60℃升高到-40℃再升高到-20℃時，最大冷凍濃度增量(cmax/c0)分別從(cong) 1.39±0.01上升到1.52±0.03到2.53±0.04。 體(ti) 積不均勻性，更具體(ti) 地說是最大濃度與(yu) 最小濃度的比率 (c max/cmin )，總結了冷凍濃度結果，高值代表高冷凍濃度。 當冷凍溫度為(wei) -20、-40和-60 ℃時，將冷凍溫度分別從(cong) 8.1倍降低到3.6倍到3.0倍，體(ti) 積不均勻性顯著改善。 一般來說，觀察到存在從(cong) 上到下的濃度梯度。 作者想提一下，采樣方法僅(jin) 提供樣品體(ti) 積的平均濃度，而真正的局部峰值冷凍濃度預計會(hui) 更高。

圖 3 | 腔室橫截麵的二維解析溫度分析。 (A) 顯示插值溫度數據，其中溫度探頭由矩形表示。 在下圖中，低於(yu) –1℃ 和高於(yu) –1℃ 的溫度分別用藍色和紅色突出顯示。 麵板 (B) 顯示了 LPTF 之前的 –45 和 –20℃ 的突出溫度。 (C) 不同設定溫度下底部和頂部溫度傳(chuan) 感器的各個(ge) 凍結時間的比較。 由溫度斜率確定的 LPTF 時間繪製為(wei) 條形圖以供參考。

圖 4 | 不同設定溫度下的冷凍和冷卻時間。 用星號標記的數據點用於(yu) 根據方程校準模型。 2，β = 1619，其中灰色區域顯示 95% 置信界限。

討論

凍結時間分析

我們(men) 演示了一種從(cong) 溫度探頭各個(ge) 位置提取凍結時間以及從(cong) 各種溫度曲線的二階導數中提取總凍結時間的方法。 單個(ge) 探針凍結檢測中的一個(ge) 常見問題是冰點降低，這會(hui) 導致諸如低於(yu) -5℃ 的固態等假設（Lashmar 等，2007）。 此外，基於(yu) 原始溫度分布的總凍結時間的檢測依賴於(yu) LPTF 位置的知識。 我們(men) 通過使用溫度二階導數的方法克服了這兩(liang) 個(ge) 問題。 然而，該方法依賴於(yu) 冷凍溫度和平衡溫度差異較大的精確和高頻數據。 隨著冷凍溫度升高，由於(yu) 絕對溫度梯度降低，信噪比降低。 因此，冷凍時間的標準偏差隨著冷凍溫度的升高而增加。 因此，通過斜率分析僅(jin) 計算 LPTF 凍結時間。 用於(yu) 計算容器頂部和底部冷凍時間的單獨冷凍時間假設溫度低於(yu) -2℃。

比較兩(liang) 種方法（如圖 3C 所示）揭示了兩(liang) 種方法的偏差。 雖然基於(yu) 導數的分析顯示出與(yu) 純化水類似的趨勢，但基於(yu) 溫度的分析通常會(hui) 導致與(yu) 預期冷凍時間的較大偏差。 盡管如此，基於(yu) 溫度的分析能夠表明 LPTF 沉降到腔室的地麵上，如下文所述。 當使用單個(ge) 熱電偶設計冷凍過程時，這一點非常重要，因為(wei) 這應該針對 LPTF。 不幸的是，與(yu) 普通熱電偶相比，光纖溫度傳(chuan) 感器的信噪比通常較低。 然而，這顯示了基於(yu) 導數的方法的適用性和穩健性。

普朗克方程的推廣

如上所示，冷凍溫度的降低如預期縮短了總冷凍時間。 正如我們(men) 基於(yu) 普朗克模型的模型所示，冷凍過程的熱力學特性可以部分解釋非線性趨勢。 基於(yu) 三個(ge) 初始水凍結測試的計算模型能夠估計較低溫度下的總凍結時間。

然而，隨著冷凍溫度的降低，我們(men) 的實驗結果與(yu) 普朗克模型的偏差更大。 這些偏差顯示了普朗克方程與(yu) 過程相關(guan) 的局限性。 與(yu) 我們(men) 的模型不同，根據所有測量數據的指數外推，對於(yu) 較低的冷凍溫度，測量值預計接近約 31 分鍾的最短冷凍時間。 由於(yu) 普朗克方程僅(jin) 適用於(yu) 階梯式冷卻溫度，因此隨著溫度降低而增加的冷卻時間可以解釋實際凍結時間的有限行為(wei) 。

圖 5 | 對溫度範圍為(wei) –60 至 –20℃ 的冷凍鑽芯進行離線樣品分析。 樣品體(ti) 積在第一張圖中以實線和虛線矩形顯示，其中測量的中心用 x 標記。 標準化濃度通過從(cong) 藍色到紅色的顏色梯度來可視化，並插值在三次重複的平均值之間 (n = 3)。

因此，引入無量綱數Ⅱ來考慮冷凍裝置的瞬態啟動條件。 對於(yu) 理想係統，隨著冷卻溫度逐步降低，II 接近 0，而在實際係統中，由於(yu) 冷卻裝置中物理傳(chuan) 熱的限製，II 預計會(hui) 隨著冷凍溫度的降低而增加。 如果超過 1，則降低設定冷卻溫度不會(hui) 導致冷卻時間進一步減少，因為(wei) 初始瞬態期超過凍結時間。 因此，溶質的低溫濃度也不會(hui) 降低。 表 1 總結了我們(men) 設置的 Ⅱ 值。在較低設定溫度下，隨著需要從(cong) 冷卻液中去除更多的熱函並且冷卻裝置在較低溫度下效率降低，Ⅱ 會(hui) 隨著冷卻時間的增加而增加。

TABLE 1 | Ⅱ values of the freezing device.表 1 | 冷凍裝置的Ⅱ值。

通過計算出的 Ⅱ 值對凍結時間進行經驗修正，顯著改進了模型。 因此，我們(men) 得出結論，當考慮瞬態啟動條件時，即使在低溫下，普朗克方程也可以用於(yu) 預測凍結時間。 此外，在進行結垢實驗或比較不同凍融過程時，Ⅱ尤其重要。 一般來說，由於(yu) 總冷凍時間短，對於(yu) 冷凍袋等小冷凍距離容器來說，II 級被認為(wei) 是最高的。 另一方麵，被動冷卻係統，如凍融瓶，由於(yu) 其階梯式冷卻溫度下降和較長的冷凍時間，將具有低的Ⅱ值。 因此，作者得出結論，從(cong) 低溫濃縮的角度來看，冷凍溫度對於(yu) 冷凍時間較長的係統（例如被動冷卻係統和冷卻容器）非常重要，Nidhi 等人也表明了這一點（Miller et al., 2013）。 相反，降低快速冷凍過程中的設定溫度可能隻能略微改善整體(ti) 均勻性和蛋白質完整性，正如有關(guan) 一次性袋凍融過程的報道(Kolhe et al., 2012; Le Saout et al.,2012;

作為(wei) 一個(ge) 應用示例，Plank 模型可用於(yu) 在監管機構麵前證明經過驗證的可接受範圍的合理性，其中較低的冷凍溫度會(hui) 導致更廣泛的可接受範圍，從(cong) 而實現更穩健的過程。

樣品溫度

在我們(men) 的設置中觀察到的冷凍過程中平行、垂直的冷凍前沿為(wei) 我們(men) 的工藝的可擴展性提供了有價(jia) 值的信息。 它強調了我們(men) 的設置中存在的最小邊界效應，這對於(yu) 小規模模型至關(guan) 重要。 在邊界效應不受控製的小規模過程中，例如瓶子中的被動冷凍，會(hui) 發生從(cong) 底部的冷凍，這可能會(hui) 影響冷凍前沿形狀和最終濃度分布，如 Kolhe 和 Badkar (2011) 所見，其中底部濃度通常較低 比上麵的層。 在使用主動冷卻係統的研究中，尚未描述邊界效應。

觀察到的另一個(ge) 現象是，LPTF 距離內(nei) 冷卻壁更近，這是由於(yu) 內(nei) 壁傳(chuan) 熱麵積較小的結果。 從(cong) 內(nei) 冷卻壁到 LPTF 的體(ti) 積以及從(cong) 外冷卻壁到 LPTF 的體(ti) 積之間的簡化能量平衡（參見補充材料）導致 LPTF 到內(nei) 壁的理論距離為(wei)  24 mm，這與(yu) 我們(men) 的研究結果一致。

當在高溫下冷凍時，LPTF 明顯下降到室的底部，這可以通過整個(ge) 過程中冷凍濃縮液體(ti) 的沉降來解釋(Singh and Nema, 2010; Kolhe and Badkar, 2011)。 濃溶液推至 LPTF 頂部與(yu) Hauptmann 等人的結果一致。 （2019）。 冷凍濃度導致溶液中產(chan) 生粘度和密度梯度，從(cong) 而引起自然對流（Butler，2002）。 此外，隨著濃度的增加，冰點會(hui) 降低。 因此，當冷凍濃度在升高的冷凍溫度下時，LPTF 位置將下沉到底部。 由於(yu) 對流增加（Authelin 等人，2020）和更大的沉降距離，這種效應在大規模應用中可能更加明顯。 通常在 LPTF 處放置溫度探頭以進行過程監控(Lashmar et al., 2007; Le Saout et al., 2012)，這可能會(hui) 在冷凍不同配方時導致錯誤結果。 因此，我們(men) 建議使用上麵討論的基於(yu) 導數的方法來基於(yu) 冷凍時間進行過程表征，因為(wei) 該方法在容器中溫度探頭的位置方麵具有靈活性。

冷凍散裝分析

一般來說，我們(men) 的發現濃度最大值高達 2.5 倍，與(yu) 主動冷卻冷凍裝置的文獻一致（2002; Rodrigues et al., 2011; Reinsch et al., 2015)，他們(men) 報道了 1.3 至 2.5 -倍冷凍濃度。 觀察到的濃度梯度可以通過溶質排除導致的冷凍濃縮來解釋(Roessl et al., 2014; Authelin et al.,2020)和前麵提到的較稠密冷凍濃縮物的沉降(Kolhe and Badkar,2011)。 在較低的冷凍溫度下將溫度降低 20℃ 時，體(ti) 積均勻性的降低幅度較小，這可以歸因於(yu) 普朗克模型所見的物理限製，在較低溫度下冷凍時間的縮短幅度較小。 這支持了我們(men) 的發現，即冷凍濃度和冷凍過程可以通過冷凍時間來表征，這與(yu) Hauptmann 等人（2019）的觀點一致。

結論

所提出的結果為(wei) 凍融過程設計和監測提供了工業(ye) 相關(guan) 指導。 展示了一種使用兩(liang) 個(ge) 獨立冷卻回路的新型凍融裝置。 雖然該模型的工程複雜性有所增加，但它能夠減少邊界效應，例如從(cong) 底部凍結。 因此，可以小規模評估工藝參數，例如 LPTF 的溫度依賴性沉降，這對於(yu) 工藝監控非常重要。 此外，將具有過程幹擾的高分辨率溫度監測方法與(yu) 基於(yu) 導數的方法相結合來計算總冷凍時間。 確定的冷凍時間對冷凍散裝的冷凍濃度曲線有很大影響。 對於(yu) 給定的主動冷卻係統，可以使用普朗克方程通過模型校準和少量凍結時間實驗來估計這些凍結時間。 然而，對於(yu) 低冷凍溫度下的實際過程，普朗克模型必須擴展無量綱數II，以考慮傳(chuan) 熱流體(ti) 和係統冷卻期間出現的啟動條件。 Ⅱ可以解釋為(wei) 什麽(me) 冷凍溫度在短距離冷凍過程中起著更重要的作用。 因此，對於(yu) 不鏽鋼容器中具有較大特征距離的冷凍過程，冷凍溫度的降低可能對冷凍體(ti) 積均勻性產(chan) 生更大的影響。 冷凍距離較短的工藝（例如冷凍袋）可能不會(hui) 因低冷凍溫度而得到改善。 因此，這些發現對製藥行業(ye) 凍融操作的未來過程分析技術策略具有重大影響。