通過直接從冷凍瓶接種抗體生產生物反應器來強化工藝

通過直接從(cong) 冷凍瓶接種抗體(ti) 生產(chan) 生物反應器來強化工藝

通過工藝強化，有幾種方法可以使抗體(ti) 生產(chan) 過程更高效、更便宜。在本研究中，使用超高細胞密度工作細胞庫將來自冷凍管的細胞直接接種到生產(chan) 生物反應器中。在實驗室規模實驗之後，成功進行了補料分批中試規模實驗作為(wei) 概念驗證。此外，細胞以 2L 規模在灌注模式下培養(yang) 。這裏介紹的強化方法可以消除生產(chan) 生物反應器外的接種物生產(chan) ，並通過節省時間和空間來創造額外的生產(chan) 能力。與(yu) 補料分批模式相比，在灌注模式下，生物反應器生產(chan) 率可提高 180% 以上。

關(guan) 鍵詞：中國倉(cang) 鼠卵巢細胞、補料分批、灌注、1:10 調節比、超高細胞密度冷凍管

1  介紹

盡管在最近的新冠疫情期間疫苗的批準和生產(chan) 激增，單克隆抗體(ti) (mAb) 仍然是最重要的生物製藥，仍然占生物製藥銷售額和新批準生物製藥的 50% 以上。這些抗體(ti) 大多用中國倉(cang) 鼠卵巢 (CHO) 細胞生產(chan) ，主要用於(yu) 治療炎症和自身免疫性疾病以及癌症 。

由於(yu) 這對生物製藥製造商的重要性，近年來 mAb 生產(chan) 工藝的改進一直是關(guan) 注的焦點，目的是降低生產(chan) 成本並實現更高的生物反應器生產(chan) 率和製造能力。該工藝強化應用於(yu) 上遊和下遊操作。在上遊工藝中，強化的重點有三個(ge) 領域：i. 細胞庫，ii. 接種物生產(chan) ，以及 iii. 抗體(ti) 生產(chan) 工藝。建立高細胞密度或大容量細胞庫以改進細胞冷凍工藝的方法已被多個(ge) 研究小組描述。

在這裏，通過在冷凍管中冷凍高達 260 × 106 細胞 mL–1 的細胞密度 [11] 或在冷凍袋中冷凍高達 150 mL 的體(ti) 積 ，可以實現每個(ge) 冷凍單位的大量細胞，這反過來又可以使解凍後搖瓶中的細胞膨脹變得過時。

為(wei) 了進一步強化種子培養(yang) ，N-1 灌注是一種選擇。在這裏，種子培養(yang) 的最後一步是在灌注模式下進行的，目標是活細胞密度 (VCD) 高達 200 ×106 細胞 mL–1，以便隨後接種生產(chan) 生物反應器 [7, 12–15]。強化細胞庫和 N-1 灌注相結合用於(yu) 一步接種物生產(chan) 已經成功實施 [6,10,15]。

例如，可以通過高接種量補料分批生產(chan) 來實現 mAb 生產(chan) 工藝的強化，即在生產(chan) 生物反應器中接種高起始 VCD，以縮短生產(chan) 過程並實現更高的產(chan) 量 。作為(wei) 補料分批工藝的替代方案，近年來，連續生產(chan) 工藝的趨勢已變得明顯。這些灌注工藝的優(you) 勢在於(yu) ，可以在數周或數月內(nei) 以恒定的濃度和質量收獲產(chan) 品，從(cong) 而簡化了下遊流程。近年來，一次性領域的新發展使得連續生產(chan) 工藝在上遊和下遊領域都變得更容易、更安全。借助現代細胞係、培養(yang) 基和一次性設備，與(yu) 補料分批工藝相比，灌注工藝可以實現更高的時空產(chan) 量。即使在傳(chuan) 統上被稱為(wei) 中試規模而非生產(chan) 規模的生物反應器中，可實現的生產(chan) 率 > 1gL–1d–1，也使得能夠同時生產(chan) 與(yu) 以補料分批模式運行的立方米規模一次性生物反應器相當數量的抗體(ti) 。此外，由於(yu) 占地麵積較小，可以同時運行多個(ge) 較小的生產(chan) 生物反應器。例如，BiosesanaPharma 擁有一種處於(yu) 臨(lin) 床 III 期的奧馬珠單抗生物仿製藥，該藥以 50L 生物反應器規模生產(chan) ，計劃成為(wei) 第一個(ge) 以連續生產(chan) 工藝生產(chan) 的抗體(ti) [30]。

在強化 mAb 生產(chan) 工藝時，還應考慮產(chan) 品質量。工藝變化會(hui) 影響質量參數。經常分析的參數是糖基化模式、抗體(ti) 電荷變體(ti) 的比例以及碎片和聚集體(ti) 的比例 [31–35]。其中一些參數是關(guan) 鍵質量屬性，即它們(men) 可能對生物活性、藥代動力學、免疫原性或安全性產(chan) 生重大影響。在功能測定和臨(lin) 床研究中，應逐個(ge) 抗體(ti) 研究關(guan) 鍵質量屬性 。

在之前的研究中，描述了一個(ge) > 250×106 細胞 mL–1 的細胞庫的建立 [11]。隨後，該細胞庫被用於(yu) 在實驗室和中試規模中成功實現低種子和高種子補料分批工藝的一步接種物生產(chan) [15]。本研究旨在通過消除生產(chan) 生物反應器之前的所有種子培養(yang) 步驟來進一步強化上遊工藝。為(wei) 此，補料分批實驗以及灌注生物反應器直接接種來自超高細胞密度工作細胞庫 (UHCD-WCB) 冷凍管的細胞（圖 1）。在中試規模中，使用 HyPerforma DynaDrive S.U.B. 生物反應器 (Thermo Scientific) 的高調節比，在 50L 生物反應器中僅(jin) 接種 5L 工作體(ti) 積。這種方法可以大大簡化生產(chan) 過程，因為(wei) 接種物生產(chan) 不再需要基礎設施和生物反應器，並且可以將手動操作減少到限度。

2 材料和方法

2.1 細胞係和培養(yang) 基

在所有培養(yang) 中，均使用產(chan) 生免疫球蛋白 G (IgG) 的 ExpiCHO-S 細胞係 (Gibco)。對於(yu) 補料分批培養(yang) ，使用 Efficient-Pro 培養(yang) 基 (Gibco) 作為(wei) 基礎培養(yang) 基，使用 Efficient-Pro Feed 2 (Gibco) 作為(wei) 補料溶液。基礎培養(yang) 基中添加了 6mmolL–1 L-穀氨酰胺 (Sigma-Aldrich) 和 0.1% 抗凝劑 (Gibco)。灌注培養(yang) 使用添加了 4mmolL–1 L-穀氨酰胺和 0.1% 抗凝劑的高強度灌注 CHO 培養(yang) 基 (Gibco)。培養(yang) 開始時使用 0.66x 濃縮培養(yang) 基，灌注時使用 1x 濃縮培養(yang) 基。

圖 1. 使用 UHCD-WCB 進行的實驗的示意圖。

2.2 接種物生產(chan)

根據 Muller 等人描述的步驟，在搖瓶（Corning）中在 7 天內(nei) 進行標準接種物生產(chan) 。在沒有種子培養(yang) 的實驗中，將來自 UHCD-WCB 的冷凍保存細胞（VCD 為(wei) 260 ×106 細胞 mL–1）解凍，然後直接轉移到培養(yang) 係統中（50L 培養(yang) ，使用裝有預熱培養(yang) 基的轉移瓶）或在搖瓶中以 1:10 的比例稀釋，並加入預熱培養(yang) 基（搖瓶和實驗室規模的生物反應器）。測定 VCD 後，將必要量的細胞懸浮液轉移到相應的培養(yang) 係統中。

2.3補料分批模式下的 IgG 生產(chan)

在三種不同的培養(yang) 係統中進行了補料分批模式的 IgG 生產(chan) 實驗：(i) 250mL 一次性搖瓶（康寧），最大工作體(ti) 積為(wei) 54mL；(ii) Ambr 250 模塊化容器（哺乳動物版，兩(liang) 個(ge) 3 葉片段攪拌器，Sartorius），最大工作體(ti) 積為(wei) 250mL；(iii) 50L HyPerforma DynaDrive S.U.B.（賽多利斯），帶有梯形攪拌器組件，該組件帶有三個(ge) 2 斜葉片攪拌器和一個(ge) 2 葉片掃掠攪拌器，最大工作體(ti) 積為(wei) 50L（圖 1）。

在第一階段，對標準接種物生產(chan) 的補料分批培養(yang) （搖瓶）與(yu) 直接接種 UHCDWCB 的冷凍保存細胞（搖瓶和 Ambr 250）進行了比較。對於(yu) 這些補料分批實驗，接種細胞密度為(wei) 0.2–0.3 × 106 細胞 mL–1。在標準接種物生產(chan) 實驗的初始批次階段 3 天後，以及將冷凍保存的細胞直接轉移到培養(yang) 係統 4 天後，開始每日補料程序。取樣後，每天以當前工作體(ti) 積 2vol% 的劑量添加補料培養(yang) 基，總共 12 天。為(wei) 了將培養(yang) 係統中的葡萄糖濃度保持在 2gL–1 以上，在需要時添加 450gL–1 葡萄糖溶液。

在第二階段，將強化補料分批培養(yang) 程序（不進行標準接種物生產(chan) ）轉移到 50L 中試規模。在這裏，解凍一個(ge) 4.5mL 的 UHCD-WCB 冷凍管，並將細胞轉移到起始體(ti) 積為(wei) 5L 的 DynaDrive 生物反應器中。根據細胞的生長情況，在第 2 天到第 6 天之間，使用基礎培養(yang) 基將工作體(ti) 積線性增加至 38L，以達到補料分批工藝的起始體(ti) 積。作為(wei) 實驗室規模的縮小比較，同時啟動一個(ge) Ambr 容器，接種相同的接種物，每天進行相同的稀釋以模擬體(ti) 積膨脹，這意味著 Ambr 以 100mL 的最小工作體(ti) 積啟動，並且在稀釋的第一天必須從(cong) 生物反應器中取出部分細胞懸浮液，以達到與(yu) DynaDrive 相同的稀釋率。從(cong) 第 7 天開始，在 12 天內(nei) 每天以 2vol% 的工作體(ti) 積進行推注喂養(yang) 。

搖瓶在 37℃、8% CO2、80% 相對濕度和 150min-1 搖動速度（搖動幅度 50mm）的搖動培養(yang) 箱中培養(yang) 。 Ambr 和 DynaDrive 中的培養(yang) 采用恒定比功率輸入 40Wm–3、37℃、0.1vvm 覆蓋通氣、pH ≤ 7.2 和溶解氧 (DO) ≥ 40% 進行。pH 和 DO 設定點通過通入 CO2 或 O2 進行控製。兩(liang) 個(ge) 係統均自動添加 1:10 稀釋的消泡劑 C (Sigma-Aldrich) 溶液。DynaDrive 生物反應器由 G3Pro 控製器 (Thermo Scientific) 控製。

2.4 灌注模式下的 IgG 生產(chan)

灌注模式培養(yang) 在配備兩(liang) 個(ge) 3 葉段式攪拌器的 3L HyPerforma 玻璃生物反應器（Thermo Scientific）中進行。使用 G3Lab 控製器（Thermo Scientific）作為(wei) 控製單元。培養(yang) 在 37℃、0.1vvm 覆蓋通氣和 165Wm–3 的恒定比功率輸入下進行。通過噴射器添加 CO2 或 O2 來控製 pH ≤ 7.2 和 DO ≥ 40%。生物反應器接種來自一個(ge) 4.5mL UHCD-WCB 冷凍管的細胞。灌注模式在培養(yang) 的第 2 天開始。根據細胞密度，每天調整一次灌注率，以保持細胞比灌注率高於(yu) 55pLcell–1d–1，直到達到 1.0d–1 的灌注率。在 23 天內(nei) 保持恒定。隨後，將接下來 12 天的灌注率增加到 1.5d–1，將最後 18 天的灌注率增加到 2.0d–1。為(wei) 了將生物反應器的體(ti) 積保持在 2L 不變，收獲泵由生物反應器的重量控製。細胞保留由 suATF2（Repligen）和 XCell Lab 控製器（Repligen）實現。平均流速為(wei) 0.9Lmin–1。為(wei) 了將活細胞體(ti) 積 (VCV) 保持在不同的設定點不變，用電容探頭（Incyte Arc、Hamilton Bonaduz）控製排氣泵。為(wei) 了將葡萄糖濃度保持在 2gL–1，添加了 450gL–1 葡萄糖溶液。為(wei) 此，使用了 CITSens MeMo 葡萄糖探頭（梅特勒-托利多有限公司，C-CIT 傳(chuan) 感器）。

2.5 分析

每天一次對補料分批和灌注實驗進行取樣，並使用 Cedex HiRes 分析儀(yi) （Roche Diagnostics）分析細胞特異性參數 VCD、總細胞密度、活力和細胞直徑。使用 Cedex Bio 分析儀(yi) （Roche Diagnostics）測定底物葡萄糖和穀氨酰胺以及代謝物乳酸和銨以及產(chan) 物 IgG 的濃度。

根據 N-糖基化、電荷變體(ti) 以及抗體(ti) 的低分子和高分子種類的比例分析抗體(ti) 質量。使用 Protein A 樹脂純化後，使用親(qin) 水相互作用超高效液相色譜分析聚糖，使用陽離子交換高效液相色譜分析電荷變體(ti) ，並使用尺寸排阻色譜分析抗體(ti) 的低分子和高分子種類

3 結果與(yu) 討論

3.1 實驗室規模的補料分批實驗

在搖瓶中分別進行了三次補料分批實驗，采用標準接種生產(chan) ，並直接從(cong) 搖瓶和 Ambr 生物反應器中的冷凍管中接種。強化工藝中的接種細胞密度為(wei) 0.20 ± 0.02×106 細胞 mL–1 (SF_int) 和 0.21 ± 0.01 ×106 細胞 mL–1 (AM_int)，而參考搖瓶中的接種細胞密度為(wei) 0.28 ± 0.03 × 106 細胞 mL–1 (SF_sta，圖 2a)。正如我們(men) 之前的研究 [11,15] 中所見，強化過程中第一天的生長率比參考實驗（SF_sta，0.038 ± 0.005h–1）低 45%，而 AM_int 為(wei) 0.017 ± 0.003h–1，SF_int 為(wei) 0.017 ± 0.005h–1，指數期偏移了大約一天。因此，飼料從(cong) 第 4 天開始，而不是第 3 天。我們(men) 之前的實驗和其他團隊已經描述了滯後階段和培養(yang) 開始時活力的輕微下降 [4, 8, 10, 11, 15]。

參考實驗中的最大 VCD 為(wei) 18.5 ± 0.9 × 106 細胞 mL–1，在第 6 天達到，在一天後的強化過程中，VCD 為(wei) 16.8 ± 1.1 × 106 細胞 mL–1（SF_int）和 13.9 ± 0.4 × 106 細胞 mL–1（AM_int）。在所有實驗中，細胞活力一直保持在 90% 以上，直到培養(yang) 結束（圖 2a）。最大 VCD 不同的原因可能是細胞在添加四到五次飼料後進入穩定期。如果此時 VCD 較低，則不會(hui) 進一步增加。因此，較低的最大 VCD 值可以歸因於(yu) 之前的生長。由於(yu) 第一次喂食時 VCD 較低（SF_int 為(wei) 3.4 ± 0.4 × 106 細胞 mL–1，AM_int 為(wei) 3.2 ± 0.3×106 細胞 mL–1，而 SF_sta 為(wei) 4.4±0.5 × 106 細胞 mL–1），且 ambr 實驗中的生長率在第 6 天和第 7 天之間保持較低（0.014 ± 0.002h–1，而 SF_int 為(wei) 0.019 ± 0.003h–1），因此最大 VCD 保持較低。

盡管如此，IgG 產(chan) 生的過程是可比的。根據生長的時間變化，IgG 的產(chan) 生也偏移了一天（圖 2b）。收獲時，可達到相當的最大 IgG 滴度 3.71 ± 0.14gL–1 (SF_sta)、3.57 ± 0.07gL–1 (SF_int) 和 3.65 ± 0.03gL–1 (AM_int)。這些滴度與(yu) 先前研究中描述的滴度相似 [15]。細胞直徑、葡萄糖、乳酸、穀氨酰胺和銨的曲線沒有顯示相關(guan) 偏差，可在支持信息 (SI；圖 S1) 中找到。結果表明，UHCD-WCB 可以消除實驗室規模補料分批工藝對接種物生產(chan) 的需要。

根據各種屬性分析了抗體(ti) 質量。N-糖基化中 G0F 聚糖的比例在 82 ± 1% (SF_int 和 AM_int) 和 84 ± 2% (SF_sta) 之間，第二高的比例是 G1F (SI 圖 S4a)。這種糖基化模式很有前景，因為(wei) 人類 IgG 在體(ti) 內(nei) 主要以 G0F、G1F 和 G2F 的形式存在 [34]。所有實驗中的電荷變體(ti) 也相似，主峰約為(wei) 40%，酸性和堿性變體(ti) 各約為(wei) 30%（SI 圖 S4b）。碎片和聚集體(ti) 的比例很低，單體(ti) 比例在 93 ± 1%（SF_sta）和 94 ± 1%（SF_int 和 AM_int）之間（SI 圖 S4c）。這些結果表明，使用 UHCD-WCB 對抗體(ti) 質量參數沒有影響

圖 2. 在搖瓶 (SF) 和 Ambr (AM) 中以標準 (sta) 和強化 (int) 接種物生產(chan) 進行補料分批培養(yang) 期間，a) VCD 和活力 (Viab) 和 b) IgG 濃度的時間過程。所有實驗的 N = 3。

3.2概念驗證中試規模補料分批生產(chan)

然而，對行業(ye) 來說更有趣的當然是 UHCD-WCB 在更大規模上開辟的可能性。由於(yu) DynaDrive 的生物反應器概念使得僅(jin) 使用 5L 的起始體(ti) 積即可工作，因此 50L 生物反應器以 0.18 × 106 細胞 mL–1 開始，僅(jin) 使用一個(ge) 4.5mL 的冷凍管進行接種（見第 2.3 節）。由於(yu) 第 2 天和第 6 天之間的連續稀釋（圖 3b），VCD 在第 4 天之前保持在 1.0 × 106 細胞 mL–1 以下，在第 6 天之前保持在 3.0 × 106 細胞 mL–1 以下，無論是在 DynaDrive 中還是在平行 Ambr 中（圖 3a）。在第一天的滯後期之後直到第 7 天第一次補料，生物反應器中的擴增生長呈指數增長。在第 11 天達到最大 VCD 17.0 × 106 細胞 mL–1（Ambr：14.7×106 細胞 mL–1）之後，DynaDrive 中的細胞存活率在培養(yang) 結束時緩慢下降至 85%，而在 Ambr 中，收獲時細胞存活率仍超過 95%（圖 3a）。盡管如此，在整個(ge) 補料分批階段，DynaDrive 中的 VCD 仍然高於(yu) Ambr。存活率較低很可能是因為(wei) 在 Ambr 中，一些死細胞被泡沫從(cong) 懸浮液中漂浮出來並粘附在生物反應器壁和其他生物反應器元件上，由於(yu) 工作體(ti) 積幾乎恒定，它們(men) 一直留在那裏（圖 3b）。另一方麵，在 DynaDrive 中，粘附在生物反應器壁上的細胞會(hui) 隨著反應器體(ti) 積的增加而再次懸浮，因此在取樣過程中也會(hui) 被檢測到。與(yu) 其他實驗相比，這兩(liang) 個(ge) 生物反應器在第 8 天之後的生長減緩是不典型的，並導致最大 VCD 相對較低。

在補料階段（從(cong) 第 7 天到第 19 天），兩(liang) 個(ge) 係統的每日特異性 IgG 生成率 qIgG 相當（圖 4b），22.2 ± 5.2 pg 細胞/天（DynaDrive）和 22.0 ± 6.2pg 細胞/天（Ambr），並且達到了相似的 IgG 濃度。經過 19 天的實驗，在 DynaDrive 中收獲了 3.58gL-1 IgG，在 Ambr 中收獲了 3.49gL-1（圖 4a），與(yu) 第 3.1 節中的標準補料分批的結果和之前的結果相當 [15]。細胞直徑、葡萄糖、乳酸、穀氨酰胺和銨的曲線沒有顯示相關(guan) 偏差，可以在支持信息中找到（圖 S2）。兩(liang) 個(ge) 補料分批工藝結束時的抗體(ti) 質量在所有屬性上與(yu) 第 3.1 節中的實驗相當，並且無法確定調整工藝的影響（SI 圖 S4）。這些結果表明，綜合起來，UHCD-WCB 和高調節比的生物反應器可以消除所有小於(yu) 50L 的生物反應器，從(cong) 而節省空間、時間和勞動力。

3.3 概念驗證 2 L 灌注

在補料分批生產(chan) 實驗中，用 UHCD-WCB 冷凍管中的細胞接種顯示出良好的結果，然而 mAb 生產(chan) 的趨勢越來越傾(qing) 向於(yu) 灌注。因此，2L 生物反應器接種了一個(ge) 冷凍管中的細胞，並在灌注模式下使用 suATF2 進行操作。在 57 天的培養(yang) 期內(nei) 測試了四種不同的 VCV 和灌注率設置，以確定 VCV 特異性抗體(ti) 生產(chan) 率和體(ti) 積生產(chan) 率最高且細胞活力不會(hui) 下降太快的 VCV 特異性灌注率範圍（表 1、圖 5a）。

圖 3. 在補料分批培養(yang) 過程中，a) VCD 和活力 (Viab) 和 b) 生物反應器體(ti) 積的時間過程，以 DynaDrive (DD) 和 Ambr (AM) 中的強化 (int) 接種物生產(chan) 作為(wei) 縮小參考 (ref)。兩(liang) 個(ge) 實驗的 N = 1。

圖 4. 在補料分批培養(yang) 過程中，a) IgG 濃度和 b) 特定 IgG 生成率 qIgG 的時間過程，以 DynaDrive (DD) 和 Ambr (AM) 中的強化 (int) 接種物生產(chan) 作為(wei) 縮小參考 (ref)。所有實驗的 N = 1。

在第一階段提供 31 μL mm–3d–1的 VCV 特定灌注率並在最後階段提供 41 μL mm–3d–1 時，細胞存活率高於(yu) 97%，但在第二和第三階段，存活率依次下降，分別為(wei) 22 和 24 μL mm–3d–1，在第 40 天降至 87%（圖 5b）。

隨著存活率的下降，細胞生長也隨之下降，因此出血率也隨之下降，反之亦然（圖 6）。在兩(liang) 個(ge) 高存活率階段，出血率約為(wei) 0.50d–1，在第 21 至 27 天之間僅(jin) 為(wei) 0.21 ± 0.07d–1，在第 29 至 38 天之間甚至僅(jin) 為(wei) 0.15 ± 0.06d–1。為(wei) 了盡可能減少因失血而造成的產(chan) 品損失，我們(men) 的目標是盡可能降低細胞生長速度 [38]。但與(yu) 此同時，細胞存活率也不能下降太多，因為(wei) 這可能會(hui) 降低 mAb 質量，增加細胞碎片和蛋白質的積累，而這些碎片和蛋白質在一定程度上會(hui) 被 ATF 截留。本研究關(guan) 於(yu) 失血率和存活率變化的結果表明，該細胞係和培養(yang) 基的最佳 VCV 特異性灌注率為(wei) 25 至 30μL/mm–3d–1

表 1. 灌注率、目標 VCV 和達到的 VCV。

這些結果也得到了產(chan) 品形成的支持。在第 21 至 27 天之間的階段，生物反應器和收獲物中的 IgG 濃度達到最高（圖 7a）。隨後 VCV 設定點和灌注率的增加再次導致 IgG 濃度降低，但體(ti) 積生產(chan) 率（根據 ATF 下遊收獲的 IgG 量相對於(yu) 生物反應器體(ti) 積計算）從(cong) 0.50 ± 0.07gL–1d–1（d21-d27）增加到 0.73 ± 0.05gL-1d-1（d29-d40）（圖 7b）。相比之下，在存活率和生長率較高的階段，隻能收獲 0.19 ± 0.04gL–1d-–1（d6-d18）和 0.29 ± 0.07gL–1d–1（d50-d57）。這不僅(jin) 是因為(wei) 出血率較高，還因為(wei) 此階段細胞的 IgG 產(chan) 物形成率 qIgG 較低（圖 7b）。體(ti) 積生產(chan) 率是灌注過程的關(guan) 鍵參數。現代工藝在 1.0–1.3d–1 的灌注率下可實現約 1gL–1d–1 的生產(chan) 率[22,23]。然而，這些過程中使用的是 CHO K1 細胞，在如此低的灌注率下，其 VCV 可以生長到 100mm3mL-1 以上，因此，與(yu) 本研究中的 VCV 特定生產(chan) 率相當，足以實現比本研究中使用的 CHO-S 細胞高得多的生產(chan) 率。

細胞直徑、葡萄糖、乳酸、穀氨酰胺和銨的進程可以在支持信息中找到（圖 S3）。在四個(ge) 目標穩態（第 15 天、第 25 天、第 35 天和第 55 天）中的每一天分析抗體(ti) 質量。盡管與(yu) 補料分批實驗相比，糖基化模式和批次變體(ti) 的分布有所不同，但在灌注實驗期間，所有質量屬性均保持不變，表明產(chan) 品質量恒定，盡管在過程中設置了不同的參數（SI 圖 S5）。

圖 5. 2L 灌注培養(yang) 期間 a) 灌注率和 VCD，以及 b) 灌注率和活力的時間過程（N = 1）。

圖 6. 2L 灌注培養(yang) 過程中灌注率和失血率的時間過程（N = 1）。

4 Conclusions 結論

在之前的研究中，研究了已建立的 UHCD-WCB 在批量模式下的生長和生產(chan) 行為(wei) [11]，並實現了一步接種生產(chan) [15]，本研究的結果表明，以及如何消除生產(chan) 生物反應器外的接種生產(chan) 。在實驗室規模的補料分批實驗中，直接從(cong) UHCD-WCB 冷凍管接種的工藝與(yu) 標準工藝僅(jin) 在一天的滯後階段有所不同。隨後，生長和生產(chan) 都具有可比性（第 3.1 節）。

對於(yu) 工業(ye) 生產(chan) 過程，中試規模的良好結果更令人感興(xing) 趣（第 3.2 節）。僅(jin) 用一個(ge) 凍存管就成功接種了 5L 工作體(ti) 積的 DynaDrive，一方麵表明使用 UHCD-WCB 並直接在生產(chan) 生物反應器中擴增細胞可以取代 10 天的標準接種物生產(chan) ，僅(jin) 需額外 4 天的擴增時間，節省 60% 的時間；另一方麵，揭示了立方米規模的補料分批工藝的兩(liang) 種可能性：(i) 50L 生物反應器可用一個(ge) 小瓶接種，可在批量或灌注模式下作為(wei) N-1 步驟操作，可用作一次性生產(chan) 規模的低種子或高種子補料分批培養(yang) 的接種物，甚至可以在不鏽鋼生物反應器中達到兩(liang) 位數的立方米規模；(ii) 通過在 UHCD 範圍內(nei) 的 150mL 冷凍袋中冷凍 WCB，可以成功接種起始體(ti) 積為(wei) 250L 的 5m3 DynaDrive 生物反應器。

此外，UHCD-WCB 還用於(yu) 概念驗證灌注實驗（第 3.3 節）。所得結果表明，優(you) 化工藝可使生產(chan) 率達到約 0.7gL-1d-1 IgG（基於(yu) 生物反應器體(ti) 積），持續數周或數月。因此，除去工藝開始時的非生產(chan) 性生長階段，在灌注模式下，在 15 天內(nei) 可收獲 10.5gL-1 IgG，而補料分批模式下則可收獲約 3.7gL-1 IgG，多出 180%。灌注結果可轉移到中試和生產(chan) 規模，類似於(yu) 補料分批結果。由於(yu) CHO K1 細胞在灌注過程中比本研究中使用的 CHO-S 細胞具有更高的生產(chan) 率，因此在 UHCD 範圍內(nei) 冷凍產(chan) 生 mAb 的 CHO K1 細胞係並使用 DynaDrive 生物反應器可以實現 50 L 規模的高產(chan) 生產(chan) 過程，其中不需要外部種子培養(yang)

圖 7. a) 生物反應器和收獲物中的 IgG 濃度和 IgG 保留率的時間過程，以及 b) 2L 灌注培養(yang) (N = 1) 期間生產(chan) 率和細胞體(ti) 積特定 IgG 生產(chan) 率 qIgG。

據作者所知，這項研究展示了在補料分批和灌注模式下直接接種來自冷凍管的細胞到生產(chan) 生物反應器。由於(yu) DynaDrive 生物反應器的調節比為(wei) 1:10，因此能夠僅(jin) 用來自一個(ge) 4.5 毫升冷凍管的細胞接種 50L 生物反應器，並直接在生產(chan) 生物反應器中進行整個(ge) 細胞擴增。所示結果使得在生產(chan) 工廠中可以隻使用生產(chan) 生物反應器，或者如果需要，隻使用額外的 N-1 生物反應器。可以省略 N-1 之前的任何培養(yang) 以及幾乎所有的手動處理步驟，從(cong) 而減少所需的勞動力、時間和空間，並降低汙染風險。

縮寫(xie) 詞

CHO      Chinese hamster ovary 中國倉(cang) 鼠卵巢

DO         Dissolved oxygen 溶解氧

IgG         Immunoglobulin G 免疫球蛋白G

mAb       Monoclonal antibody 單克隆抗體(ti)

UHCD    Ultra-high cell density  超高細胞密度

VCD       Viable cell density 活細胞密度

VCV      Viable cell volume 活細胞體(ti) 積

WCB     Working cell bank 工作細胞庫